CEMED | IV edycja warsztatów Real-time PCR w badaniach hodowli komórkowych

0
Rate this post

Reakcja łańcuchowa polimerazy DNA z analizą ilości produktu w czasie rzeczywistym (ang. real-time PCR) to jedna z najnowocześniejszych metod analitycznych mających zastosowanie w genetyce, biologii mosuplementularnej, mikrobiologii, wirusologii, onkologii, diagnostyce medycznej i innych pokrewnych dziedzinach. Wykorzystanie sond fluorescencyjnych pozwala nie tylko na monitorowanie przyrostu ilości produktu amplifikacji w każdym cyklu prowadzonej reakcji PCR, a także jego ocenę jakościową. Real-time PCR umożliwia oznaczanie ilości kwasów nukleinowych w materiale badanym oraz wykrywania nawet niewielkich zmian w obrębie amplifikowanych sekwencji, dzięki czemu technika ta jest niezwykle cennym narzędziem znajdującym zastosowanie zarówno w badaniach naukowych jak i w diagnostyce mosuplementularnej.
Prowadzenie hodowli komórkowych in vitro wciąż pozostaje standardem w wirusologii i toksykologii. Technika ta umożliwia precyzyjną kontrolę środowiska oraz ułatwia utrzymanie jednorodności badanych próbek. Jednocześnie problemem jest ocena efektu cytopatycznego oraz potencjalnej kontaminacji hodowli. Rozwiązanie tych zagadnień stanowi system xCELLigence (Roche), umożliwiający pełne monitorowanie w czasie rzeczywistym proliferacji i wzrostu komórek bez konieczności stosowania znaczników takich jak MTT, XTT czy WST-1.

Prowadzący:

  • dr Marcin Hołysz  notkaprawo_mala-3171572, Katedra i Zakład Biochemii i Biologii Mosuplementularnej, Uniwersytet Medyczny w Poznaniu
  • dr Tomasz Dzieciątkowski  notkaprawo_mala-3171572, Centralny Szpital Kliniczny, Warszawski Uniwersytet Medyczny

Umiejętności jakie muszą posiadać uczestnicy warsztatów przed przystąpieniem do zajęć:

  • elementarne zasady pracy w laboratorium (praca jałowa, obsługa pipet automatycznych)
  • przydatna będzie znajomość podstaw PCR
  • z warsztatów skorzystają również osoby, które zetknęły się już z technologią real-time PCR (wartością będzie możliwość konsultacji trudniejszych przypadków z doświadczonymi użytkownikami różnych platform sprzętowych)

Umiejętności jakie nabędą uczestnicy warsztatów:

  • dobór i zakup sprzętu do prowadzenia reakcji Real-time PCR
  • projektowanie eksperymentów – projektowanie starterów i sond do oznaczeń ilościowych i jakościowych techniką real-time PCR
  • przeprowadzanie oznaczeń ilościowych (kwantyfikacja względna i bezwzględna)
  • przeprowadzanie oznaczeń jakościowych (genotypowanie SNP)
  • rozwiązywanie problemów technicznych związanych z analizą wyników i obsługą sprzętu
  • w trakcie warsztatów będzie też możliwość konsultacji własnych wyników uczestników kursu z doświadczonymi użytkownikami różnych platform sprzętowych, praktykami w dziedzinie technik biologii mosuplementularnej)
  • podstawy prowadzenia hodowli komórkowych in vitro

Zajęcia praktyczne oparte będą o następujące reakcje, znajdujące zastosowanie w mosuplementularnej diagnostyce medycznej:

  • ilościowe oznaczanie poziomu wirusowego DNA z użyciem sond LightCycler w układzie multiplex
  • genotypowanie pojedynczo-nukleotydowych polimorfizmów (SNP) za pomocą krzywych topnienia wysokiej rozdzielczości (High Resolution Melting, HRM)
  • monitorowanie w czasie rzeczywistym zmian w hodowli komórkowej z użyciem systemu xCELLigence

PROGRAM

DZIEŃ 1 | 27 maja 2010
10.00 Rozpoczęcie warsztatów 10 min
10.10 Wykład:
Podstawy techniki Real-time PCR

  • podstawy techniki Real-time PCR
  • formaty detekcji (sondy, barwniki, fluorochromy)
  • nomenklatura związana z techniką Real-time PCR (Ct, Cp, ΔΔCt, krzywa standardowa, wydajność reakcji)
45 min
10.55 Przedstawienie planu zajęć praktycznych (przekazanie protokołów i omówienie ćwiczeń) 15 min
11.10 Zajęcia praktyczne:
Przygotowanie hodowli komórkowych do zakażenia, ocena hodowli, zakażenie hodowli
120 min
13.10 Przerwa na obiad 45 min
13.55 Zajęcia praktyczne:
Zapoznanie się z urządzeniem do prowadzenia reakcji PCR z możliwością pomiaru w czasie rzeczywistym (zasada działania, aplikacje, software)
30 min
14.25 Zajęcia praktyczne:
Przygotowanie i przeprowadzenie reakcji: Genotypowanie pojedynczonukleotydowych zmian (SNPs) metodą High Resolution Melting (HRM)
75 min
15.40 Wykład:
Projektowanie sond i primerów
dr Marcin Hołysz  notkaprawo_mala-3171572, Katedra i Zakład Biochemii i Biologii Mosuplementularnej, Uniwersytet Medyczny w Poznaniu
45 min
16.25 Wykład:
Planowanie i optymalizacja ekspermentów real-time PCR
dr Tomasz Dzieciątkowski  notkaprawo_mala-3171572, Centralny Szpital Kliniczny, Warszawski Uniwersytet Medyczny
45 min
17.00 Zakończenie dnia
DZIEŃ 2 | 28 maja 2010
9.00 Rozpoczęcie warsztatów 10 min
9.10 Zajęcia praktyczne:
Przygotowanie matrycy do reakcji PCR, czyli izolacja DNA z próbek klinicznych
100 min
10.50 Zajęcia praktyczne:
Przygotowanie i przeprowadzenie reakcji: Ilościowe badanie obecności wirusa opryszczki (HSV) z wykorzystaniem sond LightCycler oraz analizy krzywych topnienia produktów reakcji PCR
75 min
12.05 Wykład:
Praktyczne rady dotyczące zakupu i eksploatacji urządzeń real-time PCR
dr Marcin Hołysz  notkaprawo_mala-3171572, Katedra i Zakład Biochemii i Biologii Mosuplementularnej, Uniwersytet Medyczny w Poznaniu
60 min
13.05 Przerwa na obiad 45 min
13.50 Wykład:
Zastosowania techniki real-time PCR w diagnostyce medycznej
dr Tomasz Dzieciątkowski  notkaprawo_mala-3171572, Centralny Szpital Kliniczny, Warszawski Uniwersytet Medyczny
45 min
14.35 Sesja „TROUBLESHOOTING”, czyli wspólne rozwiązywanie problemów technicznych
dr Tomasz Dzieciątkowski  notkaprawo_mala-3171572, Centralny Szpital Kliniczny, Warszawski Uniwersytet Medyczny
dr Marcin Hołysz  notkaprawo_mala-3171572, Katedra i Zakład Biochemii i Biologii Mosuplementularnej, Uniwersytet Medyczny w Poznaniu
45 min
15.20 Zakończenie

ZOSTAW ODPOWIEDŹ

Please enter your comment!
Please enter your name here